Gaz Kromatografisi - Kütle Spektroskopisi

Gaz Kromatografisi - Kütle Spektroskopisi (GC-MS)
Gaz Kromatografisi Hakkında Genel Bilgi
Gaz kromatografisi, fiziksel ve kimyasal özelliklerdeki farklardan yararlanarak bir karışımı oluşturan bileşiklerin birbirinden ayrılmasıdır. Bu, yüzeyi geniş, katı bir destek (yatak) üzerinde hareketsiz duran bir faz ile bu faz üzerinde hareket faz arasında, ayrılması istenen bileşiklerin göç etme hızlarının farklı olmasından yararlanılarak yapılır. Ayrılması istenen karışım, destek katısı ve üzerindeki sabit fazla doldurulmuş cam veya metal bir kolondan geçirilerek ayırma gerçekleştirilir. Ayrılan bileşenler kolonun diğer ucunda farklı zamanlarda çıkar ve uygun bir detektörle tespit edilip miktarıyla orantılı kaydedilir. Ayrılmanın gerçekleştiği kolondan çıkan akışkanın toplamını efluenti, bunun hareketli faza ait kısmına eluent ve ayrılmış bileşene ait kısmına eluat denir.

Gaz kromatografisinde, kolon, yüksek sıcaklıkta tutularak ayrılacak maddeler gaz haline geçirildiğinden, kaynama noktası 500 oC ye kadar olan bileşikler ayrılabilir. Çünkü bugün için ancak bu sıcaklığa kadar dayanabilecek durucu fazlar geliştirilebilmiştir. Bu nedenledir ki, gaz kromatografisiyle molekül ağırlığı yaklaşık 500 e kadar olan maddeler ayrılabilir.

Gaz kromatografisi cihazı genel olarak altı kısımdan meydana gelir:
• Sürükleyici gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım,
• Numune enjekte etme kısmı,
• Kolon kısmı,
• Detektör kısmı,
• Isıtma kısmı,
• Kaydetme kısmı.

Moleküler Kütle Spektroskopisi
Kütle spektroskopi halen bulunan tüm analitik yöntemlerin en geniş uygulama alanı olanıdır ve maddelerin elementsel bileşimlerinin belirlenmesinde; inorganik, organik ve biyolojik moleküllerin yapılarının aydınlatılmasında; karmaşık karışımların kalitatif ve kantitatif analizlerinde; katı yüzeylerinin yapılarının ve bileşimlerinin aydınlatılmasında, bir numunedeki atomların izotopik oranlarının bulunmasında oldukça yararlı bir yöntemdir.

Kütle spektrometrenin rutin kimyasal analizlerde ilk kullanılmaları, 1940 lı yıllarda petrokimya endüstrisinde katalitik kraking ürünlerindeki hidrokarbon karışımlarının kantitatif analizleriyle başlamıştır. Daha önce dokuz kadar hidrokarbon içeren bu tip karışımların analizi fraksiyonlu damıtma ve sonra ayrılan bileşenlerin kırma indisleri ölçülerek yapılırdı. Böyle bir analizin tamamlanması 200 saat veya daha fazla süre gerektiriyordu. Benzer bir analiz kütle spektrometresi ile birkaç saat veya daha kısa sürede gerçekleştirilebilmektedir. Bu durum, ticari kütle spektrometrelerinin hızla gelişip yaygınlaşmasına sebep olmuştur. 1950 li yılların başında bu ticari kütle spektrometreleri kimyacılar tarafından çok sayıda organik maddenin teşhisinde ve yapı tayininde kullanılmıştır. Bu kütle spektrometrelerinin daha sonra nükleer manyetik rezonans ve geliştirilmiş infrared spektrometreleri ile birleştirilmesi sonucunda organik kimyacılar için hem madde tanımada hem de moleküllerin yapılarını aydınlatmada kullanılan mükemmel bir yöntemin ortaya çıkmasına yol açmıştır. Kütle spektrometrenin bu şekilde uygulanışı günümüzde de çok önemlidir.

Moleküler kütle spektrometrelerinin uygulamaları, 1980 li yıllarda biyokimyacı ve biyologların sık sık karşılaştıkları uçucu olmayan ve termal olarak kararsız maddeleri iyonlaştırmak için geliştirilen yöntemler sayesinde önemli ölçüde değişime uğramıştır. 1990 dan beri bu yeni iyonlaştırma yöntemlerinin sonucunda biyolojik amaçlı kütle spektrometrelerinin kullanımı çok fazla artmıştır. Günümüzde kütle spektrometreleri, polipeptitlerin, proteinlerin ve diğer yüksek molekül ağırlıklı biyopolimerlerin aydınlatılmasında kullanılmaktadır. Moleküler kütle spektrometrik ölçümlerde birkaç çeşit cihaz kullanılır. Bunlardan ikisi kuadrupol ve uçuş zamanlı spektrometrelerdir.

1. Cihaz Bileşiklerinin Genel Tanımı

Şekil 1. Bir kütle spektrometrenin bileşenleri.

Şekil 1. deki blok diyagram kütle spektrometrelerin ana parçalarını göstermektedir. Numune giriş sisteminin amacı, çok az miktardaki numuneyi (mikromol veya daha az) kütle spektrometrenin içine verebilmektedir. Burada numune gaz halde iyonlara dönüştürülür. Numune giriş bölmesi çoğu zaman katı ve sıvıları buharlaştırmak için bir ünite içerir.

Kütle spektrometrelerin iyon kaynakları, numune bileşenlerini iyonlara dönüştürür. Çoğu kez iyon kaynağı ile giriş sistemi birleştirilir. Her iki durumda da pozitif veya negatif iyonlar (çoğunlukla pozitif iyonlar) kütle analizörüne doğru hızlandırılırlar.

Kütle analizörünün işlevi, optik spektrometrelerdeki optik ağa benzer. Ancak burada fotonların dalga boylarına göre ayrılması yerine kütle/yük oranına göre ayrılma olur. Kütle spektrometreleri kütle analizörünün yapısına bağlı olarak birkaç sınıfa ayrılır.

Optik spektrometrelerdeki gibi transduserli kütle spektrometreleri (iyonlar için) iyon demetini elektriksel sinyallere çevirirler. Bu sinyaller bilgisayar sisteminde değişik şekillerde işlenir, hafızaya kaydedilir, görünürleştirilir ve grafikleşir.

Optik sistemlerde bulunmayıp kütle spektrometrelerinde bulunan karakteristik özellik sinyal işleme ve göster kısımları hariç cihazın diğer bütün bileşenlerinde sağlanmış ileri vakum (10-4 - 10-8 torr) sistemidir. Yüksek vakuma olan gereksinme yüklü parçacıklar ve elektronların atmosfer bileşenleri ile etkileşmesi ve sonuçta yok olması problemidir.

2. Numune Giriş Sistemleri
Numune giriş ünitesinin amacı, iyon kaynağına en az kaybı ile numunenin verilebilmesini sağlamaktır. Modern kütle spektrometrelerinin çoğunda pek çok numune tipine uygun olacak şekilde giriş sistemleri bulunur. Bunlara örnek olarak parti halinde numune giriş sistemleri doğrudan prob giriş sistemleri, kromatografik giriş sistemlerine kapiler elektroforez giriş sistemleri verilebilir.

Parti Numune Giriş Sistemleri: Giriş sistemleri arasında klasik sayılabilen giriş sistemi parti tipi sistemlerdir. Burada numune dışarıda buharlaştırılır, sonrada iyonlaşma bölgesine sızması sağlanır. Bu sistem, yaklaşık 500 oC ye kadar kaynama noktasına sahip katı ve sıvı numunelere uygulanabilmektedir. Gaz numuneler için gazın küçük bir hacmi iki musluk arasında tutulur. Sonra cihazın içine difüzlenmesi sağlanır. Sıvılar için numunenin küçük bir miktarı bir mikro şırınga ile cihaza verilir. 10-4 - 10-5 torr' da kaynama noktası 150 oC den büyük sıvılar için numunenin şırınga edildiği yer bir fırın veya ısıtma şeridi ile yüksek sıcaklığa çıkarılır. Maksimum ısıtma sıcaklığı 350 oC dir. Maksimum sıcaklığın bu değeri aşamayışı sistemin kaynama noktası 500 oC nin altında olduğu sıvılara uygulanmasına neden olur. Isıtma bölgesinde gaz fazına geçen numune bir metal veya cam diyaframdan geçerek iyonlaşma bölgesine ulaşır. Bu giriş sistemleri polar maddelerin absorpsiyonla kayıplarından dolayı çoğu zaman bir cam astar ile içten kaplanır.

Doğrudan Prob Giriş Sistemleri: Katılar ve uçucu olmayan sıvılar, bir vakum sızdırmazlık geçidinden numune tutucu veya prob adı verilen parça ile doğrudan iyonlaşma bölgesine gönderilir. Sızdırmazlık sistemi, numune girişi esnasında içeriye hava kaçağını en azda tutacak ve numune içeri verildikten sonra vakumla dışarıya emilebilecek şekilde tasarlanmıştır. Bu sistemler numune miktarının sınırlı olduğu durumlarda da kullanışlıdır. Çünkü bu sistemlerde parti halinde numune sistemine göre çok daha az numune kullanılır. Birkaç nanogramlık numune, bu sistemlerde kütle spektrumu için yeterlidir.

Bir probdaki numune, cam veya alüminyumdan bir kapiler borunun, ince bir tenin veya küçük bir kapsülün yüzeyinde tutulur. Prob, iyonlaştırıcı kaynağa ve spektrometreye açılan slite birkaç milimetre mesafede olacak şekilde yerleştirilir. Genellikle prob üzerindeki numuneyi soğutmak ve ısıtmak için uygun şartlar sağlanır.

İyonlaşmanın olduğu bölgedeki düşük basınç ve numunenin iyonlaştırıcı kaynağa yakınlığı genel olarak, numunenin bozunmasına zaman kalmadan spektrumun alınabilmesine olanak sağlar. Düşük basınç aynı zamanda az uçucu maddelerin iyonlaşma bölgesinde yeterli derişimde buharlaşmasını da saplar. Böylece prob, karbonhidratlar, steroidler, organometalik türler ve düşük mol kütleli polimer maddeler için araştırma imkanı getirir. Spektrumun alınabilmesi için bozunmanın başlangıcından önce 10-8 torr numune basıncı sağlanması gereği, numune miktarını belirleyen başlıca sınırlamadır.

Kromatografik ve Kapiler Elektroforez Numune Giriş Sistemleri: Kütle spektrometreleri çoğu kez bir gaz veya bir yüksek performans sıvı Kromatografi sistemine veya bir kapiler elektroforez sistemine bağlı olarak karışımların bileşenlerinin ayrılmasında ve tanınmasında kullanılırlar. Bir kütle spektrometreye kromatografik veya elektroforetik bir kolonu bağlayabilmek için özel bir giriş sistemi kullanmak gerekir.

3. Kütle Analizörleri
Farklı kütle/yük oranlarındaki iyonları ayırabilmek için pek çok cihaz kullanılabilir. İdeal olarak kütle Analizörleri küçük kütle farklarını ayırt edebilecek duyarlılıkta olmalıdır. Buna ek olarak analizörler kolayca ölçülebilir iyon akımları elde etmek için yeterli sayıda iyon geçişi sağlayabilmelidir. Kütle analizörlerinin optik eşdeğerleri olan monokromatörlerde de hem duyarlılık hem de yüksek geçirgenlik istenir ve bu iki özellikten biri geliştirilirken diğerinden ödün vermek gerekmez. Ama kütle analizörlerinde duyarlılık arttırılırken geçirgenlik azalır.

Kütle Spektrometrelerinin Ayırma Gücü: Bir kütle spektrometrenin kalitesi kütleleri ayırma yeteneği, yani onun ayırma gücü ile ifade edilir ve bu R ile tanımlanır.

R = m / M

Burada M iki komşu pik arasındaki kütle farkıdır, m ise birinci pikin kütlesidir. Eğer pikler arasındaki boşluğun yüksekliği, onların yüksekliğinin belli bir yüzdesinden (genellikle bu %10 dur) fazla değilse, iki pik ayrılmış kabul edilir. Buna göre 4000 ayırma gücüne sahip bir spektrometre 400,0 ve 400,1 veya (40,00 ile 40,01) m/z değerinde olan pikler birbirinden ayrılabilirler.

Bir kütle spektrometrede arzulanan ayırma gücü, uygulama amacına göre değişir. Örneğin, bir kütle spektrometre anma kütleleri yaklaşık aynı olan C2H4+, CH2N+, N2+ ve CO+ iyonlarını (bu iyonların anma kütleleri 28, tam doğru kütleleri sırasıyla 28,0313; 28,0187; 28,0061 ve 28,8949 dur) ayırmak için ayırma gücü birkaç bini bulan bir spektrometre gerekir. Öte yandan küçük mol kütleli iyonları, örneğin NH3+ (m = 17) ve CH4+ (m = 16) ayırt edebilmek için 50 ayırma gücü bile yeterlidir. Ticari kütle spektrometrelerinin ayırma gücü değerleri 500 den 500000 e kadar değişmektedir.

4. Moleküler Kütle Spektrometrenin Uygulamaları
Moleküler kütle spektrometresinin uygulamaları çok geniş ve kapsamlıdır. Bunlar kısaca;

• Organik ve biyokimyasal moleküllerin yapılarının aydınlatılması,
• Peptitlerin, proteinlerin ve oligonükleotitlerin mol kütlelerinin tayin edilmesi,
• İnce tabaka ve kağıt kromatografide ayrılan bileşiklerin tanınması,
• Polipeptit ve protein numunelerinde amino asit dizilişinin tayini,
• Kromatografi ve kapiler elektroforez ile ayrılan türlerin belirlenmesi ve teşhisi,
• Zararlı ilaçların ve bu zararlı ilaçların metabolitlerinin kan, idrar ve tükürükte belirlenmesi,
• Ameliyat sırasında hastanın nefesindeki gazların izlenmesi,
• Arkeolojik numunelerin yaşlarının belirlenmesi,
• Yarış atları ve olimpik atletlerde doping kontrolü,
• Aerosol oluşturan partiküllerin analizi,
• Yiyeceklerde pestisit kalıntılarının tayini,
• Su kaynaklarında uçucu organik maddelerin izlenmesi şeklindedir.

5. Kütle Spektral Yöntemlerinin Kullanıldığı İkili Tekniklerle Karışımların Analizi
Sıradan bir kütle spektrometresi saf bileşiklerin tanınması için güçlü bir araç olmakla beraber, en basit karışımların analizinde bile farklı m/z değerlerindeki iyonların çokluğu nedeniyle kullanımı sınırlıdır. Sonuçta ortaya çıkan karmaşık spektrumun yorumu çok zordur. Bu nedenle, kimyacılar kütle spektrometrelerinin değişik ayırma yöntemleri ile birleştirilmesi üzerine yöntemler geliştirmişlerdir. İki veya daha fazla analitik teknik yada cihazın daha etkili bir düzenek oluşturmak üzere birleştirilmesi olayına ikili yöntem adı verilir.

Kromatografi / Kütle Spektrometresi: Gaz kromatografisi / kütle spektrometresi (GC/MS), karmaşık organik ve biyokimyasal karışımların analizi için kullanılan güçlü bir sistemdir. Bu uygulamada kromatografik kolondan çıkan bileşikler için ayrı ayrı spektrumlar toplanır. Bu spektrumlar daha sonra işlenmek üzere bir bilgisayarda depolanır. Kütle spektrometresi ayrıca uçucu olmayan bileşenler içeren numunelerin analizi için sıvı kromatografi ile de birleştirilmiştir (LC/MS). Her iki ikili yöntemin de geliştirilmesi sırasında çözülmesi gereken en büyük problem, kromatografi sisteminde taşıyıcı gaz yada sıvı ile büyük ölçüde seyrelmenin olması yani taşıyıcı miktarının numuneye göre çok olmasıdır. Bu nedenle, numuneyi kütle spektrometreye göndermeden önce bu gaz yada sıvıyı uzaklaştırmak için yöntemler gerekir.

Kapiler Elektroforez / Kütle Spektrometresi: Kapiler elektroforezin kütle spektrometresi ile kombinasyonu proteinler, polipeptitler ve DNA türleri gibi büyük polimerlerin analizinde önemli bir yer tutar. Pek çok uygulamada kapilerden çıkan eluat, doğrudan elektrosprey iyonlaştırma cihazının içine gönderilir ve ürünler analiz için kuadrupol kütle analizörüne verilir. Sürekli akım hızlı atom bombardımanı da bazı uygulamalarda iyonlaştırmada kullanılmıştır.

Tandem Kütle Spektrometresi: Bu yöntem, bir kütle spektrometresinin bir başka kütle spektrometresiyle birleştirilmesidir. Bu birleşmede ilk spektrometre, bir karışımdaki farklı bileşiklerin moleküler iyonlarını izole etmede kullanılır. Bu iyonlar daha sonra ikinci kütle spektrometresine gönderilir ve burada ilk spektrometrede oluşan her bir iyon için ayrı ayrı bir dizi kütle spektrumu vermek üzere parçalanırlar. Bu tekniğe Tandem kütle spektrometresi (MS/MS) adı verilir.

Bir Tandem cihazında ilk spektrometrede yumuşak bir iyonlaştırma kaynağı kullanılır. Böylelikle cihazdan çıkan iyonlar büyük ölçüde moleküler iyonlar veya protonlanmış molekül iyonlardır. Bu iyonlar, ikinci spektrometreye girdikten sonra ikinci bir iyon kaynağından geçerler. Genellikle bu iyon kaynağı, içinden helyum pompalanan alansız bir çarpışma haznesi içerir. Hızlı hareket eden ana iyonlarla helyum atomlarının çarpışması sonucu daha küçük iyonik parçalar oluşur. Bu küçük iyonların spektrumu ikinci spektrometre tarafından ortaya çıkarılır. Bu gibi uygulamalarda ilk spektrometre GC/MS ve LC/MS cihazlarında olduğu gibi kromatografi kolonun yaptığı işi yapar, ikinci spektrometre birinciden gelen bu iyonlardan daha küçük saf iyonik türler üretir.

6. Kütle Spektrometresinin Uygulamaları
Kantitatif analiz için kütle spektrometresi uygulamaları iki gruba ayrılır. Birincisi organik, biyolojik ve bazen de inorganik numunelerdeki moleküler türlerin veya tiplerinin kantitatif tayinidir. İkincisi ise inorganik ve az olarak ve biyolojik numunelerdeki elementlerin derişimlerinin tayinidir.

Moleküler Türlerin Kantitatif Tayini: Kütle spektrometresi, petrol ve ilaç sanayi ile çevre araştırmalarında karşılaşılan kompleks organik (bazen de inorganik) karışımların bir veya daha fazla bileşeninin kantitatif tayininde yaygın olarak kullanılır. Bu analizler, numunenin kromatografik veya kapiler elektroforetik kolondan geçirilerek kütle spektrometresine gönderilmesiyle yapılır. Uygun bir analiz m/z değerine ayarlanan spektrometre ile iyon akımı zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilebilir. Bu tekniğe seçilmiş iyon izleme tekniği denir. Bazı durumlarda üç veya dört ayrı m/z değerine sahip akımlar, bir pikten diğerine hızlı bir geçişle dönüşümlü olarak izlenir. Bilgiler bir dizi pik olarak kaydedilir. Her pik, seçilmiş m/z değerlerinin iyonlarını veren numune bileşenlerinden bir tanesine özlü olan zaman değerinde ortaya çıkar. Genel olarak piklerin altında kalan alanlar bileşenlerin derişimleri ile doğru orantılıdır ve böylece bu alanlar analitik birer parametre gibi iş görürler. Bu tip işlemlerde, kütle spektrometresi yalnızca kantitatif kromatografik veya elektroforetik analizler için gelişmiş bir seçici detektör gibi iş görür.

Kütle spektrometresinde moleküler türler için kullanılan ikinci kantitatif analizde, piklerin yükseklikleri doğrudan kullanılır. Basit karışımlar için bazen her bir bileşe karşılık gelen m/z değerinde bir pik bulmak mümkündür. Bu şartlarda derişime karşı pik yükseklikleri grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrileri hazırlanır ve bilinmeyenlerin analizinde kullanılabilir. Belirli miktarda bir iç standart maddeyi numuneye veya kalibrasyon standardına ekleyerek daha doğru sonuçlar elde edilebilir. İç standart numune hazırlama ve cihaza verme aşamasında karşılaşılan belirsizlikleri ortadan kaldırır. İç standartlar GC/MS ve LC/MS' de de kullanılırlar ve burada pik alanlarının oranı analitik parametre olarak alınır. En iyi iç standart, analiz edilen maddenin benzeri, kararlı ve izotopik olarak işaretlenmiş bir madde olabilir. Genellikle işaretleme döteryum, karbon - 13 veya azot - 15 atomlarından biri veya birkaçının moleküllere eklenmesiyle yapılır. Analiz sırasında işaretlenmiş moleküllerin diğerleriyle aynı şekilde hareket ettiği varsayılır. Kütle spektrometreleri bu iki molekülü kolaylıkla birbirinden ayrılabilir. Bir diğer tip iç standart ise tayini yapılan maddenin parçalanmasına benzer parçalanma veren bir homolog maddedir.

Düşük ayırma güçlü cihazlarda bir karışımın her bir bileşene özgü piklerin yerini belirlemek her zaman mümkün olmamaktadır. Bu durumlarda, analizi tamamlamak için numune bileşenlerinin dayısına eşit veya daha fazla sayıda farklı m/z değerine sahip piklerin şiddetleri ölçülüp kaydedilir. Her m/z değerinin şiddeti her bileşenin bu şiddete katkısı olduğu varsayılarak, bileşen sayısı kadar denklem türetilir. Bu denklemlerin çözümü istenilen kantitatif bilgiyi verir.